题目
质粒的构建过程
希望能列出具体步骤
希望能列出具体步骤
提问时间:2021-04-02
答案
因为高拷贝质粒稳定性低,而且给宿主细胞的压力大.
低拷贝数的质粒DNA在宿主细胞分裂前只能复制1~2次,而多拷贝数质粒可以在细胞分裂前复制成10~200拷贝.
高拷贝数的质粒称为松弛型质粒(relaxed plasmid),独立于细菌细胞而自主复制;低拷贝数的质粒一般是严紧型质粒(stringent plasmid),它们的复制随细菌染色体的复制同步进行.
一般来说,外源基因的表达量随拷贝数的增加而提高,但是当拷贝数很大时,拷贝数与发酵目标产物产率的这种关系却不存在.这主要有两方面的原因:一方面,高拷贝数时外源基因的表达量不再由质粒的拷贝数决定,可能是由转录和翻译水平决定的;另一方面,高拷贝数的质粒往往很不稳定.由于质粒拷贝数的变化直接与基因目标产物的产率有关,因此对于***蛋白的生产来说,质粒的拷贝数是一个非常重要的参数.
而且同一个细胞里一般不会同时有两种不同的质粒,这是质粒不相容性(plasmid incompatibility).在细菌细胞增殖过程中,其中必有一种会被逐渐排斥.所以要用纯化过的低拷贝质粒.
低拷贝在鸟枪法测序中很常用的.
随机测序战略又称鸟枪战略(shotgun strategy),此策略是将人 类基因组DNA用机械方法随机切割成2Kb左右的小片段,把这些DNA片段装入适当载体,建 立亚克隆文库,从中随机挑 取克隆片段.最后通过克隆片段的重叠组装确定大片段DNA序列.
1991年,Hunkapiller T等首先应用鸟枪策略分析了小鼠T细胞受体和靶位的94.6kb基因组.19 95年,美国私立基因组研究所(TIGR)所长Venter JC率先应用鸟枪策略对微生物基因组测 序 并取得了成功.同年完成的流感嗜血杆菌的序列测定完全是用shotgun策略直接进行的.该实验充分证明了此策略是分析微 生物基因组全序列的有效策略之一.从1998年起,Venter领导的研究小组对人类全基因组采用鸟枪 战 略测序DNA提出大胆构想,计划在三个层次上进行测序,即对每一层次克隆的两端的称为序 列标签联结子(STC)的500bp进行测序.第一个层次用BAC做载体,插入片段为150kb,并计划 构建30万个BAC克隆,对每个BAC两端的500bp直接测序,获得10%的人类基因组序列,平均每 5kb就有一个500bp序列标记.第二层次是用低拷贝质粒作载体,插入10kb片段,构建500万 个克隆,对克隆两端的500bp测序,得到50亿个碱基序列.第三层次是用多拷贝质粒作载体 ,插入2kb片段,计划构建3000万个克隆,再对每个克隆的500个碱基直接测序,可获得300 亿个碱基序列
低拷贝数的质粒DNA在宿主细胞分裂前只能复制1~2次,而多拷贝数质粒可以在细胞分裂前复制成10~200拷贝.
高拷贝数的质粒称为松弛型质粒(relaxed plasmid),独立于细菌细胞而自主复制;低拷贝数的质粒一般是严紧型质粒(stringent plasmid),它们的复制随细菌染色体的复制同步进行.
一般来说,外源基因的表达量随拷贝数的增加而提高,但是当拷贝数很大时,拷贝数与发酵目标产物产率的这种关系却不存在.这主要有两方面的原因:一方面,高拷贝数时外源基因的表达量不再由质粒的拷贝数决定,可能是由转录和翻译水平决定的;另一方面,高拷贝数的质粒往往很不稳定.由于质粒拷贝数的变化直接与基因目标产物的产率有关,因此对于***蛋白的生产来说,质粒的拷贝数是一个非常重要的参数.
而且同一个细胞里一般不会同时有两种不同的质粒,这是质粒不相容性(plasmid incompatibility).在细菌细胞增殖过程中,其中必有一种会被逐渐排斥.所以要用纯化过的低拷贝质粒.
低拷贝在鸟枪法测序中很常用的.
随机测序战略又称鸟枪战略(shotgun strategy),此策略是将人 类基因组DNA用机械方法随机切割成2Kb左右的小片段,把这些DNA片段装入适当载体,建 立亚克隆文库,从中随机挑 取克隆片段.最后通过克隆片段的重叠组装确定大片段DNA序列.
1991年,Hunkapiller T等首先应用鸟枪策略分析了小鼠T细胞受体和靶位的94.6kb基因组.19 95年,美国私立基因组研究所(TIGR)所长Venter JC率先应用鸟枪策略对微生物基因组测 序 并取得了成功.同年完成的流感嗜血杆菌的序列测定完全是用shotgun策略直接进行的.该实验充分证明了此策略是分析微 生物基因组全序列的有效策略之一.从1998年起,Venter领导的研究小组对人类全基因组采用鸟枪 战 略测序DNA提出大胆构想,计划在三个层次上进行测序,即对每一层次克隆的两端的称为序 列标签联结子(STC)的500bp进行测序.第一个层次用BAC做载体,插入片段为150kb,并计划 构建30万个BAC克隆,对每个BAC两端的500bp直接测序,获得10%的人类基因组序列,平均每 5kb就有一个500bp序列标记.第二层次是用低拷贝质粒作载体,插入10kb片段,构建500万 个克隆,对克隆两端的500bp测序,得到50亿个碱基序列.第三层次是用多拷贝质粒作载体 ,插入2kb片段,计划构建3000万个克隆,再对每个克隆的500个碱基直接测序,可获得300 亿个碱基序列
举一反三
我想写一篇关于奥巴马的演讲的文章,写哪一篇好呢?为什么好
奥巴马演讲不用看稿子.为什么中国领导演讲要看?
想找英语初三上学期的首字母填空练习……
英语翻译
1,人们染上烟瘾,最终因吸烟使自己丧命.
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