题目

【求助】Real-time PCR 引物设计求助
通常real-time PCR的引物要分别在两个外显子上,但我要研究的target gene 只有一个内含子,而且如果非要PCR产物跨过内含子的话所得出引物特别不好,不是有严重的错配就是有dimer or cross dimer,得到的最好的一对primer如下：sense:5'GTCTTTCGGATTTCGC Tm 47.9 ,GC 50 ,length 16 ,none(hairpin,dimer,false priming,cross dimer )anti-sense:5'TCGAGGATTTCAACACTGT Tm 47.2 ,GC 42.1 ,length19,found dimer(自由能-7.3) none othersproducts size：209我觉得这对引物的Tm值过低,产物又过长,请问各位前辈,这对引物能用于定量PCR中吗?如果我们设计的引物在一个外显子上对定量的影响有多大?有什么办法可以减小引物在一个外显子上对定量的影响?

提问时间：2021-03-03

答案

博凌科为-为你1.跨越内含子主要为了避免抽提、反转录过程中残留基因组DNA污染的干扰,因为基因组DNA是不会存在两个外显子连续这样一段序列的,如果引物只在一个外显子上就要冒这种风险2.个人感觉引物能不能工作,上下游引物的Tm值要接近,这个最重要,至于别的发卡,茎环等就要看运气了,不行的话就再试几个,实在不行就用老外文献上的引物好了,记得注明参考文献就行了.good luck