题目

使用醋酸纤维素薄膜电泳的注意事项,

提问时间：2020-12-28

答案

1、醋酸纤维素薄膜的预处理
　　市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片,薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一.将干膜片漂浮于电极缓冲液表面,其目的是选择膜片厚薄及均匀度,如漂浮15s—30s时,膜片吸水不均匀,则有白斑点或条纹,这提示膜片厚薄不匀,应舍去不用,以免造成电泳后区带扭曲,界线不清,背景脱色困难,结果难以重复.由于醋酸纤维薄膜亲水性比纸小,浸泡30min以上是保证膜片上有一定量的缓冲液,并使其恢复到原来多孔的网状结构.最好是让漂浮于缓冲液的薄膜吸满缓冲液后自然下沉,这样可将膜片上聚集的小气泡赶着走.点样时,应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去,以免缓冲液太多引起样品扩散.但也不能吸得太干,太干则样品不易进入薄膜的网孔内,而造成电泳起始点参差不齐,影响分离效果.吸水量以不干不湿为宜.为防止指纹感染,取膜时,应戴指套或用镊子.
2、缓冲液的选择
醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥溶液,其浓度为0.05mol/L—0.09mol/L.选择何种浓度与样品及薄膜的薄厚有关.选择时,先初步定下某一浓度,如电泳槽两极之间的膜长度为8 cm—10cm,则需电压25V/cm膜长,电流强度为0.4mA/cm—0.5mA/cm膜宽.当电泳达不到或超过这个值时,则应增加缓冲液浓度或进行稀释.缓冲液浓度过低,则区带泳动速度快,并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高,则区带泳动速度慢,区带分布过于集中不易分辨.
3、加样量
　　加样品的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关.作为一般原则,检测方法越灵敏,加样量则越少,对分离更有利.如加样量过大,则电泳后区带分离不清楚,甚至互相干扰,染色也较费时.如电泳后用洗脱法定量时,每厘米加样线上需加样品0.1μl—0.5μl约相当于5μg—1000μg蛋白.血清蛋白常规电泳分离时,每厘米加样线加样量不超过1μl,相当于60μg—80μg的蛋白质.但糖蛋白和脂蛋白电泳时,加样量则应多些.对每种样品加样量均应先作预实验加以选择.
　　点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一,以印章法加样时,动作应轻、稳,用力不能太重,以免将薄膜弄坏或印出凹陷而影响电泳区带分离效果.
4、电量的选择
　　电泳过程应选择合适的电流强度,一般电流强度为0.4mA/cm—0.5mA/cm宽膜为宜.电流强度高,尤其在温度较高的环境中,可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发,使缓冲液浓度增加,造成膜片干涸.电流过低,则样品泳动速度慢且易扩散.
5、染色液的选择
　　对醋酸纤维素薄膜电泳后染色应根据样品的特点加以选择.其原则是染料对被分离样品有较强的着色力,背景易脱色；应尽量采用水溶性染料,不宜选择醇溶性染料,以免引起醋酸纤维素膜溶解.
　　应控制染色时间.时间长,薄膜底色深不易脱去；时间短,着色浅不宜区分,或造成条带染色不均,必要时可进行复染.
6、透明及保存
　　透明液应临用前配制,以免冰乙酸及乙醇挥发影响透明效果.这些试剂最好选用分析纯.透明前,薄膜应完全干燥.透明时间应掌握好,如在透明乙液中浸泡时间太长则薄膜溶解,太短则透明度不佳.
　　透明后的薄膜完全干燥后才浸入石蜡中,使薄膜软化.如有水,则液体石蜡不易浸入,薄膜不易平展.