题目
请问:怎样提取微生物的质粒(DNA)?
提问时间:2020-11-06
答案
碱提法:
一、试剂准备
1.溶液Ⅰ:50mM葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA(pH 8.0).1M Tris-HCl(pH 8.0)12.5ml,0.5M EDTA(pH 8.0)10ml,葡萄糖4.730g,加ddH2O至500ml.在10 lbf/in2高压灭菌15min ,贮存于4℃.
2.溶液Ⅱ:0.2N NaOH,1% SDS.2N NaOH 1ml,10%SDS 1ml,加ddH2O至10ml.使用前临时配置.
3.溶液Ⅲ:醋酸钾(KAc)缓冲液,pH 4.8.5M KAc 300ml,冰醋酸 57.5ml,加ddH2O至500ml.4℃保存备用.
4.TE:10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH 8.0).1M Tris-HCl(pH 8.0)1ml,0.5M EDTA(pH 8.0)0.2ml,加ddH2O至100ml.15 lbf/in2高压湿热灭菌20min,4℃保存备用.
5.苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)
6.乙醇(无水乙醇、70%乙醇)
7.5×TBE:Tris 碱54g,硼酸27.5g,EDTA-Na2·2H2O 4.65g,加ddH2O 至1000ml.15 lbf/in2高压湿热灭菌20min,4℃保存备用.
8.溴化乙锭(EB):10mg/ml
9.RNase A(RNA酶A):不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml,TE配制,沸水加热15min,分装后贮存于-20℃.
10.6×loading buffer(上样缓冲液):0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,40%(W/V)蔗糖水溶液.
11.1% 琼脂糖凝胶:称取1g琼脂糖于三角烧瓶中,加100ml 0.5×TBE,微波炉加热至完全溶化,冷却至60℃左右,加EB母液(10mg/ml)至终浓度0.5μg/ml(注意:EB为强诱变剂,操作时带手套),轻轻摇匀.缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中,勿使有气泡,静置冷却30min以上,轻轻拔出梳子,放入电泳槽中(电泳缓冲液0.5×TBE),即可上样.
二、操作步骤
1.挑取LB固体培养基上生长的单菌落,接种于2.0ml LB(含相应抗生素)液体培养基中,37℃、250g振荡培养过夜(约12-14hr).
2.取1.5ml培养物入微量离心管中,室温离心8000g×1min,弃上清,将离心管倒置,使液体尽可能流尽.
3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中,剧烈振荡,使菌体分散混匀.
4.加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ,颠倒数次混匀(不要剧烈振荡),并将离心管放置于冰上2-3min,使细胞膜裂解(溶液Ⅱ为裂解液,故离心管中菌液逐渐变清).
5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ,将管温和颠倒数次混匀,见白色絮状沉淀,可在冰上放置3-5min.溶液Ⅲ为中和溶液,此时质粒DNA复性,染色体和蛋白质不可逆变性,形成不可溶复合物,同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀.
6.加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇,振荡混匀,4℃离心12000g × 10min.
7.小心移出上清于一新微量离心管中,加入2.5倍体积预冷的无水乙醇,混匀,室温放置2-5min,4℃离心12000g×15min.
8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次,4℃离心8000g×7min,弃上清,将沉淀在室温下晾干.
9.沉淀溶于20μl TE(含RNase A 20μg/ml),37℃水浴30min以降解RNA分子,-20℃保存备用.
一、试剂准备
1.溶液Ⅰ:50mM葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA(pH 8.0).1M Tris-HCl(pH 8.0)12.5ml,0.5M EDTA(pH 8.0)10ml,葡萄糖4.730g,加ddH2O至500ml.在10 lbf/in2高压灭菌15min ,贮存于4℃.
2.溶液Ⅱ:0.2N NaOH,1% SDS.2N NaOH 1ml,10%SDS 1ml,加ddH2O至10ml.使用前临时配置.
3.溶液Ⅲ:醋酸钾(KAc)缓冲液,pH 4.8.5M KAc 300ml,冰醋酸 57.5ml,加ddH2O至500ml.4℃保存备用.
4.TE:10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH 8.0).1M Tris-HCl(pH 8.0)1ml,0.5M EDTA(pH 8.0)0.2ml,加ddH2O至100ml.15 lbf/in2高压湿热灭菌20min,4℃保存备用.
5.苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)
6.乙醇(无水乙醇、70%乙醇)
7.5×TBE:Tris 碱54g,硼酸27.5g,EDTA-Na2·2H2O 4.65g,加ddH2O 至1000ml.15 lbf/in2高压湿热灭菌20min,4℃保存备用.
8.溴化乙锭(EB):10mg/ml
9.RNase A(RNA酶A):不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml,TE配制,沸水加热15min,分装后贮存于-20℃.
10.6×loading buffer(上样缓冲液):0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,40%(W/V)蔗糖水溶液.
11.1% 琼脂糖凝胶:称取1g琼脂糖于三角烧瓶中,加100ml 0.5×TBE,微波炉加热至完全溶化,冷却至60℃左右,加EB母液(10mg/ml)至终浓度0.5μg/ml(注意:EB为强诱变剂,操作时带手套),轻轻摇匀.缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中,勿使有气泡,静置冷却30min以上,轻轻拔出梳子,放入电泳槽中(电泳缓冲液0.5×TBE),即可上样.
二、操作步骤
1.挑取LB固体培养基上生长的单菌落,接种于2.0ml LB(含相应抗生素)液体培养基中,37℃、250g振荡培养过夜(约12-14hr).
2.取1.5ml培养物入微量离心管中,室温离心8000g×1min,弃上清,将离心管倒置,使液体尽可能流尽.
3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中,剧烈振荡,使菌体分散混匀.
4.加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ,颠倒数次混匀(不要剧烈振荡),并将离心管放置于冰上2-3min,使细胞膜裂解(溶液Ⅱ为裂解液,故离心管中菌液逐渐变清).
5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ,将管温和颠倒数次混匀,见白色絮状沉淀,可在冰上放置3-5min.溶液Ⅲ为中和溶液,此时质粒DNA复性,染色体和蛋白质不可逆变性,形成不可溶复合物,同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀.
6.加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇,振荡混匀,4℃离心12000g × 10min.
7.小心移出上清于一新微量离心管中,加入2.5倍体积预冷的无水乙醇,混匀,室温放置2-5min,4℃离心12000g×15min.
8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次,4℃离心8000g×7min,弃上清,将沉淀在室温下晾干.
9.沉淀溶于20μl TE(含RNase A 20μg/ml),37℃水浴30min以降解RNA分子,-20℃保存备用.
举一反三
已知函数f(x)=x,g(x)=alnx,a∈R.若曲线y=f(x)与曲线y=g(x)相交,且在交点处有相同的切线,求a的值和该切线方程.
我想写一篇关于奥巴马的演讲的文章,写哪一篇好呢?为什么好
奥巴马演讲不用看稿子.为什么中国领导演讲要看?
想找英语初三上学期的首字母填空练习……
英语翻译
最新试题
- 1自惊自跳的意思 屏息静立的意思
- 2how can we get()?
- 3已知数列a0,a1,a2,...,an,...,满足关系式(3-a(n+1))(6+an)=18,且a0=3,则1/a1+.+1/ai的值是多少
- 4当a>0 证明 a+1/a≥2
- 5怎么求一组有规律的数的个数?如1,2,3,4,5…………100
- 6哪个四字词语的解释是做出了新的成绩或东西
- 7下列关于地理与人们的生活和生产的关系,正确的是
- 8某种粗细分布不均匀的香,点燃以后会燃烧整1个小时,问如何确定半个小时和45分钟?
- 9若x,y均为正实数,且x+2y+2xy=8,求x+2y的最小值.
- 10On March 11,2011_____earthquake hit japan.填a an the /
热门考点
- 1在三角形ABC中,∠BAC=90度 AD⊥BC于D E是AC的中点 ED的延长线交AB于F 求证AB*AF=AC*DF
- 25.8*5.8+0.58*42+58怎样简算,0.125*9.62*80-96.2怎样简算
- 3照样子在下列词语中间填入一个合适的字,使它与左右两边的字构成两个字
- 4波长不同的电磁波在本质上完全相同吗
- 5当X不等于1,0时,1+3x+5x^2+…+(2n-1)x^(n-1)等于多少
- 6若等式A+(a+b的平方-c)=a+c,则A-2b方为
- 7渐开线直齿圆柱外齿轮齿廓上各点的压力角它在 上的压力角为零;在 上的压力角则取为标准值.
- 8圆直径一定,周长与圆周率成( )关系. A.成正比例 B.成反比例 C.不成比例
- 9There was some orange in the cup.(改为一般疑问句) ___ there ___ orange in the cup?
- 10it managed to consisit of four mambers.they are zhou yan,yue qingshuang,liu yin and wang binyu