题目

PCR后出现非特异性扩增是什么原因?

提问时间：2021-04-01

答案

PCR产物的电泳检测时间
一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚致消失.
假阴性,不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及, ④PCR循环条件.寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究.
模板：①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消 化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚.⑤模 板核酸变性不彻底.在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处 理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应 固定不宜随意更改.
酶失活：需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性.需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭.
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因.有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度 高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为：①选定一个好的引物合成单 位.②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有 引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条 带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决.如一条引物亮度高,一条 亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度.③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效.④引物设计不合理,如引物长度不 够,引物之间形成二聚体等.
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特 异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带.
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul.或100ul,应用多 大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul 后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败.
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出 现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率.有时还有必要用标准的温度计,检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一.
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的.
假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高.
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增 时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列.靶序列太短或引物太短,容易出现假阳 性.需重新设计引物.
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交 叉污染,导致假阳性.这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔,防止 将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外.②除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或 器材均应高压消毒.所用离心管及样进枪头等均应一次性使用.③必要时,在加标本 前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸.二是空气中的小片段核酸污 染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性.可互相拼接,与引物互补后,可扩 增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除.
出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带.非特异性条带的出现,其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体.二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数 过多有关.其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增.其对策有：①必要时重新设计引 物.②减低酶量或调换另一来源的酶.③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次 数.④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸).
出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带.其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起.其对策有：①减少酶量,或调换另一来源的酶.②减少dNTP的浓度.③适当降低Mg2+浓 度.④增加模板量,减少循环次数.
克隆PCR产物的最优条件是什么?
最佳插入片段：载体比需实验确定.1：1（插入片段：载体）常为最佳比,摩尔数比1：8或8：1也行.应测定比值范围.连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶,插入片段共10ul.室温保温1小时,或4oC过夜.在这2种温度下,缺T-凸出端的载体会自连,产生蓝斑.室温保温1小时能满足大多数克隆要求,为提高连接效率,需4oC过夜.
PCR产物是否需要用凝胶纯化?
如凝胶分析扩增产物只有一条带,不需要用凝胶纯化.如可见其他杂带,可能是积累了大量引物的二聚体.少量的引物二聚体的摩尔数也很高,这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆,而非目的插入片段.为此需在克隆前做凝胶纯化.
如果没有回收到目的片段,还需要作什么对照实验?
A）涂布未转化的感受态细胞.如有菌落,表明氨苄失效,或污染上带有氨苄抗型的质粒,或产生氨苄抗型的菌落.
B）转化完整质粒,计算菌落生长数,测定转化效率.例如,将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化.用SOC稀释到1000ul后,用100ul铺板.培养过夜,产生1000个菌落.转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量.铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数.具体而言转化用10ng DNA,用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA,用1/10铺板,共用1 ng DNA.转化率为：1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞如没有菌落或少有菌落,感受态细胞的转化率太低.
C）如用pGEM-T正对照,或PCR产物,产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞）,表明载体失去T.可能是连接酶污染了核酸酶.T4 DNA连接酶（M1801,M1804,M1794）质量标准好无核酸酶污染,不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换.
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体,连接pGEM-T正对照,转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤,可得100个菌落,其中60%应为白斑,如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落,连接有问题.
对照实验结果好,却没有回收到目的片段,实验出了什么问题?
A）连接用室温保温1小时,能满足大多数克隆,为提高效率,需4oC过夜.
B）插入片段带有污染,使3`-T缺失,或抑制连接,抑制转化.为此,将插入片段和pGEM-T正对照混合,再连接.如降低了对照的菌落数,插入片段需纯化,或重新制备.如产生大量的蓝斑,插入片段污染有核酸酶,使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失.
C）插入片段不适于连接.用凝胶纯化的插入片段,因受UV过度照射,时有发生.UV过度照射会产生嘧啶二聚体,不利于连接,DNA必需重新纯化.
D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A,后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需.加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A.详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）.
E）高度重复序列可能会不稳定,在扩增中产生缺失和重排,如发现插入片段高频率地产生缺失和重排,需用***缺陷大肠杆菌菌株,如SURE细胞