题目

实验室多糖的提取方法请问有几种和具体步骤?

提问时间：2021-02-13

答案

多糖的广义分类分为： 均一性多糖和不均一性多糖.
均一性多糖：
由一种单糖分子缩合而成的多糖,叫做均一性多糖.自然界中最丰富的均一性多糖是淀粉和糖原、纤维素.它们都是由葡萄糖组成.淀粉和糖原分别是植物和动物中葡萄糖的贮存形式,纤维素是植物细胞主要的结构组分.
1、 淀粉 淀粉是植物营养物质的一种贮存形式,也是植物性食物中重要的营养成分,分为直链淀粉和支链淀粉.① 直链淀粉：许多α-葡萄糖以α(1-4)糖苷键依次相连成长而不分开的葡萄糖多聚物.典型情况下由数千个葡萄糖线基组成,分子量从150000到600000.结构：长而紧密的螺旋管形.这种紧实的结构是与其贮藏功能相适应的.遇碘显兰色.② 支链淀粉：在直链的基础上每隔20-25个葡萄糖残基就形成一个-(1-6)支链.不能形成螺旋管,遇碘显紫色.淀粉酶：内切淀粉酶（α-淀粉酶）水解α-1.4键,外切淀粉酶（β-淀粉酶）α-1.4,脱支酶α-1.6. 2、 糖元 与支链淀粉类似,只是分支程度更高,每隔4个葡萄糖残基便有一个分支.结构更紧密,更适应其贮藏功能,这是动物将其作为能量贮藏形式的一个重要原因,另一个原因是它含有大量的非原性端,可以被迅速动员水解.糖元遇碘显红褐色.
3、 纤维素结构 许多β-D-葡萄糖分子以β-(1-4)糖苷键相连而成直链.纤维素是植物细胞壁的主要结构成份,占植物体总重量的1/3左右,也是自然界最丰富的有机物,地球上每年约生产1011吨纤维素.经济价值：木材、纸张、纤维、棉花、亚麻.完整的细胞壁是以纤维素为主,并粘连有半纤维素、果胶和木质素.约40条纤维素链相互间以氢键相连成纤维细丝,无数纤维细丝构成细胞壁完整的纤维骨架.降解纤维素的纤维素主要存在于微生物中,一些反刍动物可以利用其消化道内的微生物消化纤维素,产生的葡萄糖供自身和微生物共同利用.虽大多数的动物(包括人)不能消化纤维素,但是含有纤维素的食物对于健康是必需的和有益的.
4、 几丁质(壳多糖) N-乙酰-D-葡萄糖胺以(1,4)糖苷链相连成的直链.
5、菊 糖 ：多聚果糖,存在于菊科植物根部.
6、 琼 脂 ：多聚半乳糖,是某些海藻所含的多糖,人和微生物不能消化琼脂.
不均一性多糖
有不同的单糖分子缩合而成的多糖,叫做不均一多糖.常见的有：透明质酸、硫酸软骨素等.
有一些不均一性多糖由含糖胺的重复双糖系列组成,称为糖胺聚糖(glyeosaminoglycans,GAGs),又称粘多糖.(mucopoly saceharides)、氨基多糖等.糖胺聚糖是蛋白聚糖的主要组分,按重复双糖单位的不同,糖胺聚糖有五类：
1、透明质酸
2、硫酸软骨素
3、硫酸皮肤素
4、硫酸用层酸
5、肝素
6、硫酸乙酰肝素
植物活性多糖的提取方法有多种,在水提醇沉的基础上,常采用酶解、微波、超声波,膜处理和CO超临界萃取等方法进行辅助提取或精制.最常用的还是水提醇沉法.
举例: 蒽酮比色法,具体步骤
一、仪器、试剂和材料
1.仪器：电子天平,超声波清洗器,电热恒温水浴锅,抽滤设备,分光光度计,容量瓶,刻度吸管等
2.试剂：
(1)葡萄糖标准液：l00 µg/mL
(2)浓硫酸
(3)蒽酮试剂：0.2 g蒽酮溶于100 mL浓 H2SO4中.当日配制使用.
3.材料：甜高粱,甘草

二.操作步骤
1.葡萄糖标准曲线的制作
取7支大试管,按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液：
管号
1
2
3
4
5
6
7

葡萄糖标准液（mL）
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.6
0.8

蒸馏水（mL）
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.4
0.2

葡萄糖含量（µg）
0
10
20
30
40
60
80

在每支试管中立即加入蒽酮试剂4.0mL,迅速浸于冰水浴中冷却,各管加完后一起浸于沸水浴中,管口加盖,以防蒸发.自水浴沸腾起计时,准确煮沸l0 min,取出,用冰浴冷却至室温,在620 nm波长下以第一管为空白,迅速测其余各管吸光值.以标准葡萄糖含量（µg）为横坐标,以吸光值为纵坐标,绘出标准曲线.
2.植物样品中可溶性糖的提取：将样品粉碎,105 ºC烘干至恒重,精确称取1~5 g,置于50mL三角瓶中,加沸水25mL,加盖,超声提取10 min,冷却后过滤（抽滤）,残渣用沸蒸馏水反复洗涤并过滤（抽滤）,滤液收集在50mL容量瓶中,定容至刻度,得可溶性糖的提取液.
3.稀释：吸取提取液2mL,置于另一50mL容量瓶中,以蒸馏水定容,摇匀.
4.测定：吸取1 mL已稀释的提取液于试管中,加入4.0 mL蒽酮试剂,平行三份；空白管以等量蒸馏水替代提取液.以下操作同标准曲线制作.根据A620平均值在标准曲线上查出葡萄糖的含量（µg）.

三、结果处理：
C × V总 × D
样品含糖量（%）= ————————————— × 100%
W × V测 × 106
其中：C——在标准曲线上查出的糖含量（µg）,
V总——提取液总体积（mL）,
V测——测定时取用体积（mL）,
D——稀释倍数,
W——样品重量（g）,
106——样品重量单位由g换算成µg的倍数
溶剂提取法
溶剂提取法是从植物中提取多糖的常用方法,溶剂提取法首先要考虑的因素是选择溶剂,一般应遵循相似相溶的原则,即极性强的有效成分选择极性强的溶剂,极性弱的成分选择极性弱的溶剂.多糖是极性大分子化合物,应选择水、醇等极性强的溶剂.在所有溶剂中,水是典型的强极性溶剂,对植物组织的穿透力
强,提取效率高,在生产上使用安全.它能用于各种植物多糖,被广泛应用.用水作溶剂来提取多糖时,可以用热水浸煮提取,也可以用冷水浸提.水提取的多糖大多是中性多糖.一般植物多糖提取多数采用热水浸提法,该法所得多糖提液可直接或离心除去不溶物；或者利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质,用高浓度乙醇沉淀提纯多糖；但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同,它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离；还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖进行分离；其中,以乙醇沉淀最为普遍.刘青梅等在紫菜粗多糖提取方式研
究中,热水提取控制条件为：温度为20~100℃,水与紫
菜的液固质量比为50:1,提取时间30~180min,经多次
试验最终得率为2.05%.周峙苗得到热水浸提羊栖菜
多糖的最佳因素：浸提温度为煮沸(102℃),pH为3.0,
浸提时间为3h,液固质量比为40:1.李战对三种紫球
藻的提取工艺研究表明,三种紫球藻的最佳提取工艺
各不相同.铜绿紫球藻的最优提取工艺为乙醇浓度
5%,乙醇用量为3倍体积,醇沉时间为1.5h.氯仿与正
丁醇的比例4:1,样液与Sevag试剂的比例1:2,作用时
间为15min.淡色紫球藻的最优提取工艺为乙醇浓度
75%,乙醇用量为2倍体积,醇沉时间为1h,氯仿与正
丁醇的比例3:1,样液与Sevag试剂的比例1:2,作用时
间为45min.血色紫球藻的最优提取工艺为乙醇浓度
50%.乙醇用量为1倍体积,醇沉时间为0.5h,氯仿与
正丁醇的比例4:1,样液与Sevag试剂的比例2:1,作用
时间为45min.
酸碱提取法
有些多糖适合用稀酸或碱溶液提取,才能得到更
高的提取率.但酸碱提取法有其特殊性,因多糖类的不
同而异.只在一些特定的植物多糖提取中占有优势,而
且即使有优势,在操作上还应严格控制酸碱度.因为
某些多糖在酸性或者碱性较强时,可能引起多糖中糖
苷键的断裂.另外,稀酸、稀碱提取液应迅速中和或迅
速透析,浓缩与醇析而获得多糖沉淀.赵宇等对海篙
子多糖的提取方法研究发现,从硫酸根含量及粗多糖
产率看酸提方法好于水提方法.具体方法为：100g海
篙子干粉,加入1000ml 0.1mo1/L HCL溶液提取.室温
搅拌1h后过滤,重复操作三遍,合并滤液；滤液减压浓
缩至总体积的1/5,再加入95%乙醇至乙醇浓度达
30%,沉淀,离心除去沉淀中的褐藻酸,继续向上清液
中加入乙醇至乙醇浓度达7%.室温放置过夜使沉淀
完全,离心,沉淀干燥得海篙子粗多糖,多次试验算得
平均产率为3.35%.
孟宪元等在茜草多糖提取研究中发现酸提相对
多于水提,以稀酸提取茜草多糖,产品纯度较高.具体
方法如下茜草根粗粉1000g 5%HCL浸泡、离心、取上
清液加入ETOH并调节至浓度为7%,静置,2500rpm
离心,收集棕色沉淀物,95%ETOH洗涤3次,用45%
HCL溶解.加1%活性炭脱色,真空抽滤,滤液4℃过
夜,弃去容器底部少许沉淀物.溶液置透析袋内,逆水
法透析3d,冷冻干燥,得白色粉末状多糖约10g.
Hayashi Katsuhiko发明了一种从绿色藻类中提取酸
性多糖的方法,而这种多糖用常规的热水法是无法得到的.具体过程为：将干燥的绿藻粉末制成悬浮液,热
水浸泡提取或将含水绿藻直接用热水提取后离心分
离,取粘稠的固状物,加入碱水,在pH≥10的条件下
再进行搅拌提取,碱水提取液在搅拌的同时加入酸水
调节pH值为3.0~4.0,静置沉降后离心得酸性多糖.
1.3生物酶提取法
酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一
项生物技术,在多糖的提取过程中,使用酶可降低提取
条件,在比较温和的条件中分解植物组织,加速多糖的
释放或提取.此外,使用酶还可分解提取液中淀粉、果
胶、蛋白质等的产物,常用的酶有蛋白酶,纤维素酶,果
胶酶等.孟江研究不同酶对大枣渣多搪提取效果的
影响,根据多糖得率、多糖含量及蛋白质含量进行综合
评分得到最适合的酶为复合酶2(先胰蛋白酶提取,后
木瓜蛋白酶提取),接下来依次是木瓜蛋白酶、复合酶、
(木瓜蛋白酶+胰蛋白酶)、胰蛋白酶、胃蛋白酶
(pH=7.0)、胃蛋白酶(pH=2.0).复合酶2作用条件温
和,多糖得率及含量较高,且蛋白含量较低,实为一种
理想的酶提取剂.通过进一步正交实验考察得出最佳
工艺：先用胰蛋白酶3%,40倍体积在pH=7.0,65℃温
浸1.5h后,再加木瓜蛋白酶2.5%,在pH=7.0,50℃水
温浸1h,过滤残渣加40倍体积水,迅速升温至80℃,
然后温浸1.5h.
此外,植物多糖的提取方法还有超滤法,超声波强
化法,微波法等等.植物多糖的提取方法和技术在不断
改进和创新,但对于同一种方法和技术又需在不同植
物多糖的提取中研究考察.在选取提取分离方法的同
时,应当根据目标多糖的特点、物理化学性质,综合比
较,进行实验,选取最佳方法和提取工艺.