题目

做RT-PCR内参的作用是什么?应该如何选择管家基因

提问时间：2021-01-03

答案

你说的应该是real time PCR吧,注意RT其实是逆转录reverse transcription的缩写,和real time一定要分开来.
常说的qPCR,qRT-PCR,都是通过实时（real time）的方法,测定样品中某个模版的起始量ct值
但是呢,由于之前RNA提取、反转等步骤,各个步骤存在不同的效率,ct值并无法真实反应样品中模版的绝对量,因此,需要一个内参来做为参考.
比方说,A基因的ct值,在a样品中是18,在b样品中是20,由于a b样品存在RNA质量等等一系列不同,你无法直接就判断这个基因在a样品中的表达量是b样品的4倍.
这时候,我们需要一个内参,假如内参ct值在a样品中是14,而在b样品中是15.由于内参的稳定性,在不同样品中被认为是表达量一致的,因此,A基因的在ab样品之间的-ΔΔct值是1,也就是表达量为2倍的关系.
这里,我们可以知道内参的作用,即通过测量内参,可以在后面分析过程中将不同样品的起始量均一化.内参需要选择在不同样品中有稳定表达量的基因,这就是为什么内参经常选择看家基因的原因.以小鼠为例,常用的内参有actin gapdh hprt等等.
当然,现在的很多观点认为这些基因在不同组织中丰度也不同,例如gapdh,在线粒体含量高的组织中丰度高,很多人认为用基因组DNA做内参会更加靠谱,当然这是后话了,选择gapdh无碍于现阶段的实验,如果觉得不靠谱,可以选择两个内参.
你所研究的物种,应该有人已经发表过相应的内参,直接上数据库搜就可以了.
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