题目

琼脂糖凝胶电泳检测DNA 电泳所得各条带都是什么

提问时间：2021-01-03

答案

溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,用于观察琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA.溴化乙锭用标准302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号,可用Polaroid 底片或带CCD成像头的凝胶成像处理系统拍摄.
　　观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色,溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团.它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性.在高离子强度的饱和溶液中,大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子.当染料分子插入后,其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用.这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近,导致与DNA结合的染料呈现荧光,其荧光产率比游离溶液中染料有所增加.DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料,而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射.这两种情况下,被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来.由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍,所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5ug/ml）时,可以检测到少至10ng的DNA条带.
　　溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA）.但是染料对单链核酸的亲和力相对较小,所以其荧光产率也相对较低.事实上,大多数对单链DNA或RNA染色的荧光时通过染料结合到分子内形成较短的链内螺旋产生的.
　　尽管在该染料存在的情况下,线状DNA的电泳迁移率约降低15%,因此,当需要知道DNA片段的准确大小（如DNA限制酶酶切图谱的鉴定）,凝胶应该在无EB情况下电泳,电泳结束后用EB染色.染色完毕后,通常不需要脱色.但是在检测小量DNA（小于10ng）片段时,通常要将染色后的凝胶进行脱色