题目

要测胰蛋白酶活,可是植物胰蛋白酶怎么制备啊?
不是胰蛋白酶，是胰蛋白酶抑制剂

提问时间：2020-12-30

答案

反胶束萃取制备胰蛋白酶
　　胰蛋白酶（EC 3 . 4 . 4 . 4 ）是从猪、牛等哺乳动物胰脏提取的一种以丝氨酸为活性中心的蛋白水解酶,可提高组织、血管的通透性、液化血块、血脓纤维及坏死组织等,用于治疗炎症、溃疡、创伤等引起的脓肿及支气管炎、肺气肿等.
　　( 1 ）工艺流程
　　( 2 ）主要步骤
　　① 制备粗酶液 称取定量粗胰酶,其胰蛋白酶活性为25 . 7U /mg,胰淀粉酶活性为18.4U/mg,胰脂肪酶活性为63.7U/mg.将其用pH 值为5 . 25 、浓度为0．2mol / L 的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解,然后进行真空过滤,收集滤液并用磷酸缓冲液进行稀释,使胰蛋白酶活性为3-10U / mg ,备用.
　　② 制备反胶束 将AOT置于100 ℃ 烘箱中干燥至恒重,放入干燥器中冷却至室温.然后称取44.4369 置于配制罐中,加入10L异辛烷,在搅拌下使其形成均匀的分散液,再加入定量蒸馏水,在200r/min的转速下处理2h ,获得浓度为0 .lmol / L 的透明AOT-异辛烷反胶束溶液.使用时用异辛烷稀释10 倍.
　　③ 萃取 将稀释10 倍的AOT-异辛烷反胶束置于萃取器中,按照AOT 异辛烷反胶束：粗酶溶液体积比为（2 -3 ) : 1 的比例加入粗酶溶液萃取3 - 4 次,在300 - 400r / min 的转速下萃取5 -10min .如此每次萃取完成后,均进行离心分离,离心机转速为4000 - 6000r / min ,时间10 -15min 收集、合并离心上层清液,进行反萃取,下层萃余液用于制备胰脂肪酶.
　　④ 反萃取 将荷载胰蛋白酶的AOT -异辛烷反胶束置于萃取器中,在搅拌下加入等体积的反萃取液进行反萃取15 -20min 萃取液为0．02 -0.05mol / L 的NaCI 溶液.如此反萃取3 次,每次萃取完成后,均进行离心分离,离心机转速为4000 -6000r / min,时间为15 -20min .分别收集、合并离心上层清液和下层反萃取液,前者再生后可再次萃取胰蛋白酶,后者进行超滤浓缩.
　　⑤ 脱盐、浓缩 将反萃取液置于截留分子量2 万的超滤膜中,在0 . 1 ～0.2MPa 的压力下进行脱盐及浓缩处理,直至处理液体积降低至原液体积的1 / 5 左右时停止,获得脱盐浓缩液.
　　⑥ 干燥 将浓缩液置于冻干瓶中,在-60～-50 ℃ 、真空度为25～5OMPa 的条件下干燥24h ,获得纯化胰蛋白酶冻干粉.
　　( 3 ）主要指标
　　浅黄色粉末,胰蛋白酶的总萃取率为74 . 2 % ,胰蛋白酶活性为3145 . 3U/ mg ,纯化45 . 16 倍；胰淀粉酶活性为0 . 58U / mg ,降低4 . 66 倍；无脂肪酶活性.
　　实例234 猪胰中分离核糖核酸酶A、胰蛋白酶、凝乳蛋白酶和激肚释放酶
　　采用提取、盐析、反胶束、离子交换、凝胶分子筛层析等技术,可从猪胰脏中同时获得核糖核酸酶A 、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和激肤释放酶,有显著的经济效益.
　　( 1 ）用该方法同时制备上述四种酶的工艺流程
　　( 2 ）主要步骤
　　① 提取、盐析 取0.5kg 猪胰,除脂肪及结缔组织后绞碎,加入其3 倍质量的乙酸提取液搅拌提取24h .提取液温度为4 ℃ ,pH 值为4 . 0 ,硫酸浓度为0．125mol / L .提取完成后用4 层纱布过滤,收集滤过液约1250-1300mL ,在搅拌下加入约750g 固体硫酸钱溶解,使溶液达到75 ％饱和度.4000r / min 转速离心15min , 分别收集上层清液（约1500mL ）和盐析沉淀物（约40 -45g ）.
　　② 制备核糖核酸酶A 取收集的上层清液,在搅拌下加入固体硫酸铵溶解,使溶液达到85 ％饱和度.4 000r / min 转速离心15min ,弃清液.将沉淀溶于等体积蒸馏水,用10 ％乙酸钠调节pH 值为6 . 0 ,上用浓度为0 .0lmol / L 、pH6 .0磷酸缓冲液（PBS ) 平衡过的CM - SepharoseFF 柱,CM - SepharoseFF 用量与上柱液体积之比为1 : 5 ( g / mL ）.接着用2 倍树脂床体积的上述平衡缓冲液洗涤荷载核糖核酸酶A 的CM -SepharoseFF 色谱柱后,分别用0．01mol / L 、pH6 ．0和0．lmol / L 、pH7 . 5 磷酸缓冲液进行梯度洗脱,收集活性峰液,调节其pH 值为8 . 0 ,上用0．05mol / L 、pH 8 . 0 磷酸缓冲液平衡的Sephacryls -200 柱,Sephacryls -200 用量与上柱液体积之比为1 : 5 （g/mL ）.然后用同样的缓冲液梯度洗脱,收集活性峰液,进行透析、脱盐、冻干,获得核糖核酸酶A 冻干粉.
　　③ 制备胰蛋白酶取75 ％饱和度的硫酸钱盐析沉淀,用10 倍蒸馏水溶解,加入盐析沉淀质量30 ％的CaCI ：粉末,调节pH 值为8 . 0 ,再加入5 ～ 10mg 粗胰蛋白酶,于4 ℃ 下激活24h .过滤除去硫酸钙沉淀,调节滤液pH 值为7 . 8 ,加入定量对氨基苯甲脒－sepharose6B ,搅拌下吸附lh ,纱布过滤,收集滤液用于分离其他酶.将吸附胰蛋白酶的对氨基苯甲眯一S 叩harose6B 树脂用pH 值为7 . 8 、浓度为0 . lmol / L Tris 一0 .05mol / L HCI 的缓冲液（含0 . lmol / L CaC12 ）抽滤洗涤,缓冲液用量为树脂体积的2 倍.洗涤完成后将树脂装柱,用其1 倍体积的相同缓冲液平衡.再用20 倍树脂体积的0 . lmol / L 甲酸-0 . 05mol / L KCI 缓冲液洗脱,洗脱液pH 值为2 . 2 ,洗脱流速为2 ～3 倍树脂体积／h .收集洗脱活性峰进行透析,冻干,获得胰蛋白酶.
　　④ 弹性蛋白酶制备取未被对氨基苯甲脒-Sepharose6B 吸附的滤液,对水透析至透析管内产生沉淀时止.用400Or / min 的转速离心15min ,收集上层清液用于制备弹性蛋白酶.沉淀用5 ～ 6 倍体积的Tris-HCI 缓冲液溶解,该缓冲液浓度为0．02mol / L 、pH 值为8 . 8 .将溶解液用稀NaOH 调节pH 值为10 . 4 ,上用上述缓冲液平衡好的DEAE －纤维素柱,溶解液与DEAE -纤维素的比为（5 ～6 ) ： 1 ( mL / g ）.上柱完成后再用同样的缓冲液以2 ～3 倍树脂体积／h 的流速洗涤,缓冲液用量为1 倍树脂体积.弹性蛋白酶在此条件下不被交换,收集洗涤活性峰,对水透析,冻干,即得弹性蛋白酶.比活力2010U / mg ,活力回收10 ％.
　　⑤ α-糜蛋白酶制备 将制备弹性蛋白酶时的离心清液用乙酸钠调节pH 值为5 ．0,上用0 . lmol / L 、pH 5 . 0 柠檬酸缓冲液平衡的S- SepharoseFF 柱.用2 倍柱体积的、同样缓冲液以3mL / min 洗涤树脂,收集洗涤液待制备激肤释放酶.用300mL 0 . 01～0.05mol / L 、pH5.0柠檬酸缓冲液梯度洗脱,收集活性峰组分( 160 ～200mL ) ,透析,冻干,即得α-糜蛋白酶.
　　⑥ 胰糜蛋白酶制备 取制备弹性蛋白酶时的离心上层清液,用乙酸钠调节pH 值为3 . 5～ 4 . 0 ,加入等体积0.lmol / L AOT 反胶束,在200r /min 搅拌下萃取5min , 4000r / min 离心5min .收集上层有机相,萃余液再用等体积0.lmol / L AOT 反胶束重复萃取2 次.合并有机相,加入等体积、含lmol / L KCI 、pH8.0的0.02mol / L 碳酸盐缓冲液,在200r /min 搅拌下反萃取5min , 60 00r/min 离心5min ,收集下层水相,萃余液同法反萃取2 次.合并反萃取液,对水透析脱盐,冻干,得胰糜蛋白酶.
　　⑦ 激肽释放酶制备 取用0.01mol/ L 、pH 5.0柠檬酸缓冲液洗涤S-SepharoseFF 柱的洗涤液,用柠檬酸调节pH 值为4 . 5 ,按洗涤液：丙酮=1：0.35 的比例加入丙酮,于-4 ℃ 冰箱中放置2h , 过滤.滤液中加入乙酸钠和NaCI ,使其浓度分别达到0.O65mol / L 和0.035mol / L .继续加入丙酮,使体积比达到65 ％.抽滤,滤饼用少量蒸馏水溶解,用稀乙酸调节pH 值为4 . 2 ,再次产生沉淀.抽滤,滤饼用少量蒸馏水溶解后用稀乙酸钠调节pH 值为6 . 8 ,对水透析脱盐后上用浓度为0.1mol / L 、pH6 . 8 磷酸缓冲液平衡的轻基磷灰石柱,上柱液与经基磷灰石的比为（5 ～ 6 )：l ( mL / g ）.用0 . 01 ～0.2mol/L 、pH6 . 8 磷酸缓冲液以1～ 1 . 5 倍树脂柱体积／h 进行梯度洗脱,洗脱液用量约为上柱液体积的1～1 . 5 倍.收集活性峰组分,对水透析脱盐后加到经过重新平衡的另一羟基磷灰石柱上,改用0.05 ～0.2mol / L 、pH6 . 8 磷酸缓冲液进行梯度洗脱.收集活性峰组分,再次对水透析脱盐后,冻干,获得激肽释放酶.
　　( 3 ）主要指标
　　核糖核酸酶A 的活力回收≥75 .％,比活力为71000U/mg；胰蛋白酶的活力回收≥60 % ,比活力为23750U / mg ；弹性蛋白酶的活力回收≥10 % ,比活力为2010 U / mg ；胰糜蛋白酶活力回收≥70 % ,比活力为150U / mg ；胰激肤释放酶活力回收≥6 % ,比活力为130U / mg .