题目

过氧化氢酶的测定

提问时间：2020-12-06

答案

　　使用过氧化氢酶检测试剂盒是比较简便的方法：
　　过氧化氢酶检测试剂盒(Catalase Assay Kit)是一种简单易行的通过显色反应来检测细胞、组织或其它样品中过氧化氢酶
　　(Catalase)活性的试剂盒.在过氧化氢相对比较充足的情况下,过氧化氢酶可以催化过氧化氢产生水和氧气.残余的过氧化
　　氢在过氧化物酶(Peroxidase)的催化下可以氧化生色底物,产生红色的产物(N-(4-antipyryl)-3-chloro-5-sulfonate-p-
　　benzoquinonemonoimine),最大吸收波长为520nm.用过氧化氢标准品,制作标准曲线,这样就可以计算出样品中的过氧化氢
　　酶在单位时间单位体积内催化了多少量的过氧化氢转变为水和氧气,从而可以计算出样品中过氧化氢酶的酶活力.
　　Ø 过氧化氢酶分布非常广泛.在肝脏、肾脏和红细胞中,过氧化氢酶的水平非常高,这些器官和细胞是清除能导致氧化损伤的过氧
　　化氢的主要场所.
　　Ø 过氧化氢酶的活性也可以用紫外分光光度计测定A240,但蛋白质或其它组份在A240附近都有比较强的吸收,会对测定产生严重干
　　扰.因此,用紫外法测定过氧化氢酶的活性,比较适合纯化的过氧化氢酶.本试剂盒通过检测A520来测定过氧化物酶催化下由过
　　氧化氢氧化生色底物产生的红色产物,受干扰的因素小,检测灵敏度高,可以检测出低达1U/ml的过氧化氢酶.
　　Ø 本试剂盒可以检测全血、红细胞裂解产物、血清、组织匀浆产物、细胞裂解产物等生物样品中的过氧化氢酶的活性.一个试剂盒
　　共可以进行100次检测.
　　使用方法：
　　配制250mM过氧化氢溶液.本试剂盒提供的过氧化氢浓度约为1M.由于过氧化氢不是非常稳定,使用前需自行测定过氧化氢的
　　实际浓度.把浓度约为1M的过氧化氢用本试剂盒提供的过氧化氢酶检测缓冲液稀释100倍,使过氧化氢的浓度约为10mM.测定
　　A240.
　　过氧化氢(mM)=22.94XA240
　　从而计算出本试剂盒提供的过氧化氢的实际浓度.然后再根据实际的过氧化氢浓度配制250mM过氧化氢溶液.
　　b.配制5mM过氧化氢溶液.根据测定得到的实际过氧化氢浓度配制5mM过氧化氢溶液.
　　c.配制显色工作液.在冰浴上溶解显色底物,适当分装后再使用,尽量避免反复冻融.其它试剂放置在冰浴上备用.取适当量的过
　　氧化物酶,按照1:1000的比例用显色底物稀释,配制成显色工作液.例如取5微升过氧化氢酶,加入5ml显色底物,混匀即得到
　　5ml显色工作液.
　　2.样品的准备：
　　用适当的裂解液裂解细胞或组织(可以使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液进行裂解).用本试剂盒提供的过氧化氢酶检测
　　缓冲液稀释样品,裂解好的样品至少加入等体积的过氧化氢酶检测缓冲液进行稀释.具体的稀释倍数可以参考表1.