题目

怎样从总RNA中提取mRNA?原理是什么?
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提问时间：2020-12-02

答案

大多数真核细胞mRNA的3’端通常具有由20-30个腺苷酸组成的polyA尾巴,寡聚胸腺嘧啶脱氧核糖核苷（OligoT）可以与之配对结合,这就是提取mRNA最基本的原理.具体到实验手段上,现在磁珠法、纤维素柱层析法都有在用.
磁珠法一般是用生物素标记OligoT,亲和素标记磁珠（生物素和亲和素间具有高度亲和力）.实验时生物素标记的OligoT与mRNA的polyA高效杂交形成复合体,此复合体又与标有亲和素的磁珠结合.用磁性分离架就可以将这堆复合物分离出来.最后用无RNase去离子水将mRNA从复合物中洗脱下来即可.
寡聚dT纤维素柱层析法的大致流程：总RNA流经寡聚dT纤维素柱时,在高盐缓冲液中,带polyA尾的mRNA被特异地结合在柱上.降低盐浓度,mRNA被洗脱.一般过两次柱后,就可得到较高纯度的mRNA.
当然有些mRNA没有polyA尾巴,这种就比较难办了,我最近的实验就是在对付这种东西.如果你是拿mRNA做RT-PCR,其实一般是不必分离mRNA的,设计好引物就可以用总RNA做了.