题目

PCR的扩增产物是什么 是如何扩增出来的

提问时间：2020-11-16

答案

可分为长产物片段和短产物片段两部分.短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间,是需要扩增的特定片段.短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,以两条互补的DNA为模板,引物是从3'端开始延伸,其5'端是固定的,3' 端则没有固定的止点,长短不一,这就是“长产物片段”.
进入第二周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合.引物在与新链结时,由于新链模板的5'端序列是固定的,这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点,保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”.不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加,而“长产物片段”则以算术倍数增加,几乎可以忽略不计,这使得PCR的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯DNA片段供分析.
反应体系由模板DNA、一对引物、dNTP、耐高温的DNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必须的离子等所组成.PCR反应循环的第一步为加热变性,使双链模板DNA变性为单链；第二步为复性,每个引物将与互补的DNA序列杂交；第三步为延伸,在耐高温的DNA聚合酶作用下,以变性的单链DNA为模板,从引物3ˊ端开始按5ˊ→3ˊ方向合成DNA链.这样经过一个周期的变性——复性——延伸等三步反应就可以产生倍增的DNA,假设PCR的效率为100%,反复n周期后,理论上就能扩增2n倍.PCR反应一般30-40次循环,DNA片段可放大数百万倍.
常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增,变性温度为95℃,复性温度为37℃～55℃,延伸合成温度为72℃,DNA聚合酶为Taq酶（可耐受95℃左右的高温而不失活）,反应循环数为30.