题目

M13噬菌体DNA提取方法?

提问时间：2020-11-15

答案

M13和其它的丝状噬菌体载体,在文库构建和为序列测序提供单链DNA和引人突变方面十分有用.将适量M13丝状噬菌体或者相关噬粒（M13来源）感染的液体培养物离心,上清中的单链噬菌体DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤,将盐、细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将纯净噬菌体单链DNA从硅基质膜上洗脱.
博凌科为 M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒 目录号 1421
操作步骤:（实验前请先阅读注意事项）
以800μl噬菌体感染细菌培养上清提取举例:
提示：第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
1.将M13丝状噬菌体或者相关噬粒（M13来源）感染的液体培养物分装在1.5毫升离心管,12,000rpm离心5分钟沉淀菌体.
2.小心取800μl上清转入新的1.5ml离心管,加入400μl结合液MB,充分混匀.
如果使用的上清大于或者小于800μl,则结合液MB的用量需要按照比例增加或者减少.
3.将上述混合物加入一个吸附柱AC中,（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心15秒,倒掉收集管中的废液.
吸附柱一次最多只可以容纳大约700μl混合物,因此需要分次把混合物加到吸附柱内,重复步骤3.
4.加入700μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!）,12,000rpm 离心30秒,弃废液.
5.将吸附柱AC放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应.
6.取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加60μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 50℃水浴中预热）,室温放置1分钟,12,000rpm 离心1分钟.如果想得到较多量的DNA,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,10,000rpm离心1分钟.
洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于40μl,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量.
7.DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放,可以放置在－20℃.
v 附录（M13噬菌体感染细菌培养上清准备过程）:
下面举例说明M13噬菌体感染细菌培养上清准备过程,详细的M13噬菌体（或M13来源噬粒）培养和上清准备过程请参见『分子克隆』第二版.
1.37℃ 振摇过夜培养合适的噬菌体宿主菌（如JM109）.
2.使用6％的过夜培养菌接种新鲜的LB培养液,37℃振摇培养一个小时.
3.根据M13噬菌体的储存液的浓度（滴度）按照0.5-1.5%(V/V)的比例加入噬菌体来感染宿主菌.37℃振摇培养5-6个小时.
4.将上面M13丝状噬菌体或者相关噬粒（M13来源）感染的液体培养物分装在1.5毫升离心管,12,000rpm离心5分钟沉淀菌体.
5.可选步骤:小心取1毫升上清转入新的1.5ml离心管,重复步骤4离心5分钟.
这步有助于去除上清中残留的微量宿主菌RNA或者DNA.
6.小心取800μl上清转入新的1.5ml离心管.
7.现在可以按照博凌科为说明书的操作步骤提取噬菌体单链DNA了.