题目

做荧光定量PCR和半定量PCR有什么区别?半定量的PCR退火温度和荧光定量PCR是一样的吗?

提问时间：2020-10-23

答案

荧光定量PCR和半定量RT-PCR都可以用来检测基因的表达量的,但二者检测的东西多少有些不同.荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入可以和双链DNA特异性结合的荧光染料（sybr green）或者和目的DNA片段结合的荧光探针（taqman),通过监控PCR过程中的荧光的变化,并且和某些管家基因的荧光变化进行对比反应出目标基因的表达量.荧光定量PCR的主要有效数据是荧光信号增长到最大值的一半时的时间.半定量RT-PCR则是通过RT-PCR最终产物电泳后电泳条带的明暗来间接反应出原始模板的丰度.荧光定量PCR因为是全程监控PCR扩增的变化,并且能够同管家基因的扩增曲线进行相对定量,而将基因的表达量数值化,准确度高于半定量RT-PCR.半定量RT-PCR因为是监控的最终产物,而在基因表达水平很高的时候,PCR体系很可能在反应中后期就饱和了,所以对于高水平表达的基因来说,用半定量RT-PCR并不能很准确的说明问题.但是如果要发表比较高档次的论文的话,某些变态的老外审稿并不认可单一的荧光定量PCR的结果,他们会同时需要作者做一个半定量RT-PCR来作为辅助证明.
半定量RT-PCR的引物和荧光定量PCR的引物设计原则并不是一样的,换而言之,二者的引物并不是可以通用的.所以退火温度自然是不同的,具体怎么不同,要根据实际用到的引物去算.