题目

PCR与DNA复制有何异同?

提问时间：2020-10-13

答案

PCR是DNA的体外扩增技术.
DNA复制是有生命力的细胞在体内 自我复制的过程 ,属于体内扩增.
PCR(聚合酶链式反应)原理
PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法,主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温（95℃）下,待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下,两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合,形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下,以引物3’端为合成的起点,以单核苷酸为原料,沿模板以5’→3’方向延伸,合成DNA新链.这样,每一双链的DNA模板,经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子.如此反复进行,每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板,每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍,PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增,经过25～30个循环后,理论上可使基因扩增109倍以上,实际上一般可达106～107倍.
DNA复制过程:
(一)复制的起始
1.螺旋的松弛与解链
⑴拓扑异构酶---能改变DNA空间构像的酶
作用：DNA复制时松弛超螺旋,以利复制叉的行进及DNA合成,合成后再引向超螺旋.
功能：不清楚,可催化体外拓扑异构化反应,拓扑异构酶分两型.
拓扑异构酶I （topoisomerase-- I ）
作用：松弛超螺旋,不需ATP,作用机制：切开环状一条链、打结与解结
原核：拓扑异构酶I对负超螺旋作用>正超螺旋
真核：拓扑异构酶I对正、负超螺旋均有作用.
拓扑异构酶Ⅱ---旋转酶（gyrase）
作用：松弛超螺旋,作用机制：切开环状两条链、打结与解结、环连与解环连
⑵解链酶 （helicase）---复制蛋白rep
作用：ATP供能时,解开DNA双链.
原核：编码解链酶的基因是dnaB.前导链结合rep蛋白,随从链结合解链酶II、Ⅲ
⑶单链结合蛋白（SSB）
作用：SSB与解开DNA单链结合,保护稳定DNA.与新复制DNA单链结合,以防其降解.
螺旋松弛与解链过程如图所示
2.引发
⑴引物酶（primase）
作用：以DNA为模板,自5'→3'合成RNA小片段约十几到几十个核苷酸,3'末端为-OH.
原核：dnaG基因编码DnaG蛋白即引物酶.
⑵引发前体（preprimosome）
由多种蛋白因子组成复合物.
作用：合成RNA引物,沿随从链复制叉的行进方向移动,在不同部位,合成RNA引物.
小结：合成RNA引物,在引物3'-OH末段进行DNA片段合成.
二 DNA链的延长
反应体系：DNA模板,DNA聚合酶,dNTP,引物,Mg2+
反应式：DNA+dNTP→（DNA）n+1+ppi
真核与原核中DNA聚合酶（DNA polymorase-DNApol）：
有几种类型,作用方式相同,但各具特性及功能.
1.大肠杆菌DNA聚合酶（3种）
⑴pol I：催化5'→3'的聚合作用,合成20个核苷酸即离开模板,填充空隙.
3'→5'外切酶活性,去除错误碱基,有校对作用.
5'→3'外切酶活性,去除RNA引物及修正错误碱基.
⑵pol II：催化5'→3' DNA合成并具有3'→5'外切酶活性,体内功能不清楚.
⑶pol Ⅲ:DNA链延长起主要作用,细菌中以1000dNTP/秒进行聚合反应.
3'→5'外切酶活性,校对作用,与pol I配合使错误率降至10-6.如图所示
DNA复制的保真性：遵守严格的碱基配对规律.-聚合酶对碱基的选择功能.聚合酶对错误碱基的校读作用.以上三种作用确保了DNA复制的准确性.
2、真核生物DNA聚合酶
特性与大肠杆菌相似,共五种：α、β、γ、δ、ε
⑴polδ：催化前导链及随从链的合成,需增殖细胞核抗原蛋白PCNA的参与.
⑵polα：与引发酶配合,参与随从链的合成.
⑶RFA（replication factor A）：DNA延长中RFA与单链结合起到SSB的作用.
三终止
连接酶（ligase）：使相邻的DNA片段,以3',5'磷酸二酯键相连,需ATP供能.